Doktorant loendab rakke 3 tundi. TI loendab samad preparaadid 90 sekundiga ega lähe iseendaga vastuollu teisipäeva ja reede vahel.
Rakkude loendamine on üks korduvamatest ülesannetest bioloogias, farmakoloogias ja meditsiiniuuringutes. Iga rakukultuuri katse, ravimidoseerimise uuring ja elujoulisuse test algab sama küsimusega: mitu rakku on selles proovis? Traditsiooniline vastus hõlmab hematsütomeetrit, mikroskoopi ja palju kannatlikkust. TI-põhised loendamisvahendid annavad nüüd tulemusi sekunditega, parema järjepidevusega kui isegi kogenud operaatorid.
Käsitsi loendamise rutiin
Käsitsi rakkude loendamine hematsütomeetriga järgib rituaali, mis pole sajandi jooksul peaaegu muutunud. Kandke proov loenduskambrisse. Asetage katteklaas. Fokuseerige mikroskoop. Loendage neli nurkvadraniti. Arvutage keskmine. Korrutage lahjenduskoefitsiendiga. Märkige arv üles. Korrake järgmise prooviga.
Üks proov voetab kogenud tehnikul 10-15 minutit. Tüüpiline rakukultuuri päev voib hõlmata 10-30 proovi ja katsed, mis nõuavad ajalise kulgemise jälgimist, korrustavad seda tundide voi päevade lõikes. Matemaatika koguneb kiiresti: uurimisrühm, mis teostab mitmeid analüüse, voib kergesti kulutada 20-30 tundi nädalas ainuüksi loendamisele.
Suurem probleem pole aeg, vaid varieeruvus. Uuringud näitavad, et hematsütomeetri loendamise operaatoritevaheliine varieeruvus voib ulatuda koguni 52%-ni ja isegi üks operaator tekitab kuni 20% varieeruvust sama proovi korduvate loenduste vahel. Kambri täitmise vead moodustavad ligikaudu 4,6%, pipeteerimine lisab veel 4,7% ja isegi katteklaasi asetus tekitab 7,6% erinevust. Kui need veaallikad kokku liita, nõuab alla 15% variatsioonikoefitsiendi saavutamine sadade rakkude loendamist mitmes kambris.
Kuidas TI rakkude loendamine töötab
TI rakkude loendamine algab sama sisendiga: mikroskoobipildiga. Erinevus on selles, mis järgneb. Inimese asemel, kes silmi kissitades kvadrante vaatab, segmenteerib arvutinägemise mudel pildi, tuvastab üksikud rakud ja tagastab arvu usaldusmärgistega, tavaliselt alla 30 sekundi pildi kohta.
Sellised tööriistad nagu SnapCyte töötavad otse standardsete hematsütomeetri piltidega, mis on jäädvustatud 10X suurendusega mikroskoobikaamera voi isegi nutitelefoni adapteri kaudu. TI tuvastab automaatselt ruudustikujooned, tuvastab rakud loenduspiirkondades ning arvutab kontsentratsiooni ja elujõulisuse. See toetab Neubauer, Improved Neubauer ja Burker kambri tüüpe ilma käsitsi seadistamiseta.
Adherentsete rakkude puhul kultuuriplaatidel kasutab TI-täiustatud mikroskoopia faasikontrast- voi fluorestsentsipildistamist rakkude tuvastamiseks otse anumas. Ilma trüpsiniseerimiseta, proovi ülekandeta, hematsütomeetrita. Rakud jäävad oma kasvukeskkonda häirimata.
Täpsus ja korratavus
TI rakkude loendamine saavutab vähem kui 6,26% keskmise absoluutse protsentuaalse vea elusate ja surnud rakkude segude puhul, mis on oluliselt parem kui käsitsi hematsütomeetri loendamise 15-52% varieeruvuse vahemik. Veelgi olulisem, TI annab iga kord sama tulemuse, kui töötleb sama pilti.
Korratavus on tegelik eelis. Ravimisõeluuringus kandub 20% varieeruvus lähterakkude arvus edasi igasse järgmisse arvutusse: IC50 väärtused nihkuvad, doosi-vastuse kõverad kõiguvad ja katsed vajavad rohkem kordusi statistilise olulisuse saavutamiseks. Järjepidev loendamine alguses kitsendab iga järgnevat tulemust.
10-15 minutit proovi kohta. Variatsioonikoefitsient: 5-15% kogenud kasutajatel, kuni 52% operaatorite vahel. Tulemused sõltuvad sellest, kes loendab ja millal.
Alla 30 sekundi pildi kohta. Peaaegu nullilähedane operaatoritevaheline varieeruvus. Sama pilt, sama arv, iga kord.
Rakutüübid, mis hästi toimivad
TI loendamine saab hakkama laia valiku rakutüüpide ja preparaatidega.
- Suspensioonrakud (CHO, Jurkat, PBMC): lihtne tuvastamine trüpaansinise elujoulisuse värvimisega
- Adherentsed rakud kultuuris: faasikontrastpildistamine loendab rakke neid plaadilt tostmata
- Vererakud: valgete vereliblede diferentsiaalid ja trombotsüütide arvud värvitud äigepreparaatidelt
- Bakterikolooniad: loendage KMÜ-sid agarplaatidel ühelt fotolt
- Pärmrakud: punguvate ja mittepunguvate eristamine olletvalmistuse ja biotehnoloogia rakendusteks
Peamised väljakutsed on tugevasti kattuvad rakuklastrid, tihedad prügiväljad ja väga väikesed rakud, mis on alla mikroskoobiobjektiivi lahutusvõime piiri. Enamiku standardsete rakukultuuri tööde puhul 10X-20X suurendusega on TI loendamine juba tootmisvalmis.
Kuidas alustada ilma uue riistvarata
Sisenemisbarjäär on madalam, kui enamik teadlasi ootab. TI rakkude loendamise tööriistad töötavad olemasolevate mikroskoobikomplektidega, spetsiaalset automaatset loendurit pole vaja. Piisab standardsest laborimikroskoobist kaamerakinnitusega. Moned tööriistad töötavad isegi nutitelefonipiltidega, mis on tehtud läbi okulaari.
Laborite jaoks, mis juba kasutavad hematsütomeetreid, on üleminek kohene: jäädvustage pilt, mida tavaliselt silmaga loendaksite, laadige see üles ja saage arv usaldusväärsuskatendiga. Hematsütomeeter jääb, silmaga loendamine kaob.
Kokkuvote
Rakkude loendamine on olnud käsitsi tehtav subjektiivne kitsaskoht uurimislaborites üle sajandi. TI ei muuda bioloogiat - see muudab aega, järjepidevust ja loenduse usaldusväärsust. Alla 30 sekundi 15 minuti asemel. Alla 6% viga 15-52% varieeruvuse asemel. Sama tulemus teisipäeval ja reedel.
Järgmine kord, kui rakukultuuri katse algab 30 minuti hematsütomeetri loendamisega, proovige kambrit pildistada. Arv on valmis enne, kui inkubaatori uks sulgub.