Аспiрант рахує клiтини 3 години. ШI рахує тi самi препарати за 90 секунд i не суперечить собi мiж вiвторком i п'ятницею.
Пiдрахунок клiтин - одне з найбiльш повторюваних завдань у бiологiї, фармакологiї та медичних дослiдженнях. Кожен експеримент з клiтинною культурою, дослiдження дозування лiкiв та тест на життєздатнiсть починається з того самого питання: скiльки клiтин у цьому зразку? Традицiйна вiдповiдь потребує гемоцитометра, мiкроскопа та великого терпiння. Iнструменти пiдрахунку на базi ШI тепер видають результати за секунди з кращою узгодженiстю, нiж навiть досвiдченi оператори.
Рутина ручного пiдрахунку
Ручний пiдрахунок клiтин з гемоцитометром слiдує ритуалу, який майже не змiнився за столiття. Завантажити зразок у лiчильну камеру. Покласти покривне скло. Сфокусувати мiкроскоп. Порахувати чотири кутовi квадранти. Обчислити середнє. Помножити на коефiцiєнт розведення. Записати число. Повторити для наступного зразка.
Один зразок займає вiд 10 до 15 хвилин у досвiдченого технiка. Типовий день клiтинної культури може включати вiд 10 до 30 зразкiв, а експерименти, що потребують монiторингу в часi, множать це на години або днi. Пiдрахунок швидко накопичується: дослiдницька група, яка проводить кiлька аналiзiв, може легко витрачати вiд 20 до 30 годин на тиждень лише на пiдрахунок.
Бiльша проблема - не час, а варiабельнiсть. Дослiдження показують, що мiжоператорська варiацiя при пiдрахунку на гемоцитометрi може сягати 52%, i навiть один оператор дає до 20% варiацiї мiж повторними пiдрахунками того самого зразка. Помилки заповнення камери вносять близько 4,6%, пiпетування додає ще 4,7%, i навiть позицiонування покривного скла вводить рiзницю в 7,6%. Коли цi джерела помилок накопичуються, досягнення коефiцiєнта варiацiї кращого за 15% потребує пiдрахунку сотень клiтин у кiлькох камерах.
Як працює пiдрахунок клiтин з ШI
Пiдрахунок клiтин з ШI починається з того самого входу: зображення з мiкроскопа. Рiзниця в тому, що вiдбувається далi. Замiсть людини, що примружує очi на квадранти, модель комп'ютерного зору сегментує зображення, iдентифiкує окремi клiтини та повертає пiдрахунок з маркерами достовiрностi, зазвичай менш нiж за 30 секунд на зображення.
Iнструменти на кшталт SnapCyte працюють безпосередньо зi стандартними зображеннями гемоцитометра, отриманими при збiльшеннi 10X через камеру мiкроскопа або навiть адаптер для смартфона. ШI автоматично виявляє лiнiї сiтки, iдентифiкує клiтини в областях пiдрахунку та обчислює концентрацiю i життєздатнiсть. Пiдтримує камери типу Нойбауера, полiпшеного Нойбауера та Бюркера без ручного налаштування.
Для адгерентних клiтин у культуральних планшетах ШI-покращена мiкроскопiя використовує фазово-контрастну або флуоресцентну вiзуалiзацiю для виявлення клiтин безпосередньо в посудинi. Без трипсинiзацiї, без перенесення зразка, без гемоцитометра. Клiтини залишаються непорушеними у своєму середовищi росту.
Точнiсть i вiдтворюванiсть
Пiдрахунок клiтин з ШI досягає середньої абсолютної вiдсоткової похибки менше 6,26% для сумiшей живих i мертвих клiтин - суттєво краще, нiж дiапазон варiацiї вiд 15 до 52% при ручному пiдрахунку на гемоцитометрi. Що ще важливiше, ШI дає той самий результат щоразу при обробцi того самого зображення.
Вiдтворюванiсть - це справжня перевага. При скринiнгу лiкiв 20%-ва варiацiя в базових пiдрахунках клiтин каскадно поширюється на кожен наступний розрахунок: значення IC50 зсуваються, кривi доза-вiдповiдь коливаються, i експерименти потребують бiльше повторiв для досягнення статистичної значущостi. Послiдовний пiдрахунок на початку уточнює кожен наступний результат.
Вiд 10 до 15 хвилин на зразок. Коефiцiєнт варiацiї: вiд 5 до 15% для досвiдчених користувачiв, до 52% мiж операторами. Результати залежать вiд того, хто рахує i коли.
Менше 30 секунд на зображення. Майже нульова мiжоператорська варiацiя. Те саме зображення, той самий результат, щоразу.
Типи клiтин, якi добре працюють
Пiдрахунок з ШI обробляє широкий спектр типiв клiтин та препаратiв.
- Суспензiйнi клiтини (CHO, Jurkat, PBMC): просте виявлення з фарбуванням життєздатностi трипановим синiм
- Адгерентнi клiтини в культурi: фазово-контрастна вiзуалiзацiя рахує клiтини без вiддiлення їх вiд планшета
- Клiтини кровi: диференцiали лейкоцитiв та пiдрахунок тромбоцитiв з пофарбованих мазкiв
- Бактерiальнi колонiї: пiдрахунок КУО на агарових чашках з однiєї фотографiї
- Дрiжджовi клiтини: диференцiацiя брунькуючих i небрунькуючих для пивоварних та бiотехнологiчних застосувань
Основнi труднощi - сильно перекриваючi клiтиннi кластери, щiльнi поля дебрису та дуже маленькi клiтини нижче межi роздiльної здатностi об'єктива мiкроскопа. Для бiльшостi стандартних робiт з клiтинною культурою при збiльшеннi вiд 10X до 20X пiдрахунок з ШI готовий до виробничого використання.
Початок роботи без нового обладнання
Порiг входу нижчий, нiж очiкує бiльшiсть дослiдникiв. Iнструменти пiдрахунку клiтин на базi ШI працюють з iснуючими установками мiкроскопiв, спецiалiзований автоматичний лiчильник не потрiбен. Стандартний лабораторний мiкроскоп з камерою достатнiй. Деякi iнструменти працюють навiть зi зображеннями зi смартфона, знятими через окуляр.
Для лабораторiй, що вже використовують гемоцитометри, перехiд миттєвий: сфотографуйте зображення, яке зазвичай рахували б очима, завантажте його та отримайте пiдрахунок з накладенням достовiрностi. Гемоцитометр залишається, напруження очей зникає.
Пiдсумок
Пiдрахунок клiтин був ручним, суб'єктивним вузьким мiсцем у дослiдницьких лабораторiях понад столiття. ШI не змiнює бiологiю - вiн змiнює час, узгодженiсть та достовiрнiсть пiдрахунку. Менше 30 секунд замiсть 15 хвилин. Менше 6% похибки замiсть 15-52% варiабельностi. Той самий результат у вiвторок i в п'ятницю.
Наступного разу, коли експеримент з клiтинною культурою почнеться з 30 хвилин пiдрахунку на гемоцитометрi, спробуйте сфотографувати камеру. Результат буде готовий до того, як зачиняться дверцята iнкубатора.