Doktorantas skaiciuoja lasteles 3 valandas. DI suskaiciuoja tuos pacius preparatus per 90 sekundziu ir nesipriestaarauja sau pats tarp antradienio ir penktadienio.
Lasteliu skaiciavimas yra viena is dazniausiai besikartojianciu uzdduociu biologijoje, farmakologijoje ir medicininiuose tyrimuose. Kiekvienas lasteliu kulturos eksperimentas, vaistu dozavimo tyrimas ir gyvybingumo testas prasideda tuo paciu klausimu: kiek lasteliu yra siame meeginyje? Tradicinis atsakymas apima hemocitometra, mikroskopa ir daug kantrybes. DI skaiciavimo irankiai dabar pateikia rezultatus per sekundes su geresniu nuoseklumu nei net patyre operatoriai.
Rankinio skaiciavimo rutina
Rankinis lasteliu skaiciavimas hemocitometru atliekamas pagal rituala, kuris beveik nepakito per simtmeti. Uzpildykite meegini ant skaiciavimo kameros. Uzdekite dengiamaaji stikleeli. Sufokusuokite mikroskopa. Suskaiciuokite keturis kampinius kvadrantus. Apskaiciuokite vidurki. Padauginkite is skieedimo koeficiento. Uzrasykite skaiciuu. Pakartokite su kitu meginiu.
Vienas meginys uzima 10-15 minuciu patyrusiam technikui. Tipiska lasteliu kulturos diena gali apimti 10-30 meginiu, o eksperimentai, reikalaujantys laiko kurso stebeesenos, tai padaugina per valandas ar dienas. Matematika greitai susikaupia: moksliniu tyrimu grupe, vykdanti kelis tyrimus, gali lengvai praleisti 20-30 valandu per savaite vien skaiciuodama.
Didesne problema yra ne laikas, o kintamumas. Tyrimai rodo, kad hemocitometru skaiciuojanciu operatoriu variacija tarp operatoriu gali siekti net 52%, o net vienas operatorius sukuria iki 20% variacijos tarp pakartotiniu to paties meginio skaiciavimu. Kameros uzpildymo klaidos sudaro apie 4,6%, pipetavimas prideda dar 4,7%, o net dengiamojo stiklelio padeties nustatymas sukelia 7,6% skirtuma. Kai sudete siuos paklaidu saltinius, norint pasiekti geresni nei 15% variacijos koeficienta, reikia skaiciuoti simtus lasteliu keliose kamerose.
Kaip veikia DI lasteliu skaiciavimas
DI lasteliu skaiciavimas prasideda nuo to paties ivesties: mikroskopo vaizdo. Skirtumas yra tai, kas vyksta toliau. Uuzviet zmogaus, ziiuuirincio i kvadrantus, kompiuterio vaizdo modelis segmentuoja vaizda, identifikuoja atskiras lasteles ir graazina skaiciau su patikimumo zymekliias, paprastai per maziau nei 30 sekundziu vienam vaizdui.
Tokie irankiai kaip SnapCyte veikia tiesiogiai su standartiniais hemocitometro vaizdais, uzfiksuotais 10X didinimu per mikroskopo kamera arba net ismaniojo telefono adapteri. DI automatiskai aptinka tinklelio linijas, identifikuoja lasteles skaiciavimo srityse ir apskaiciuoja koncentracija bei gyvybinguma. Jis palaiko Neubauer, Improved Neubauer ir Burker kameru tipus be rankinio konfiguuravimo.
Adherentinems lastelems kulturos plokstelesee DI pagerintas mikroskopijos naudoja fazines kontrasto arba fluorescencines vaizdinimo technologijas, kad aptiktu lasteles tiesiogiai inde. Be tripsinizacijos, be meginio perkelimo, be hemocitometro. Lasteles lieka nepaliiestos savo augimo aplinkoje.
Tikslumas ir atkuriamumas
DI lasteliu skaiciavimas pasiekia mazesne nei 6,26% vidutine absoliucia procentine paklaida gyvu ir mirusiu lasteliu maisiniams, kas yra zymiai geriau nei 15-52% rankinio hemocitometru skaiciavimo variacijos diapazonas. Svarbiausia, kad DI kiekvienaa karta pateikia ta pati rezultata, kai apdoroja ta pati vaizda.
Atkuriamumas yra tikrasis pranasumas. Vaistu patikroje 20% bazinio lasteliu skaiciaus variacija pereina per kiekviena tolesni skaiciavima: IC50 vertes keiciasi, dozes-atsako kreives svyruoja, o eksperimentams reikia daugiau pakartotojumu, kad pasiektu statistini reiksmiinguma. Nuoseklus skaiciavimas pradzhioje sustandrina kiekviena velesnii rezultata.
10-15 minuciu vienam meginiui. Variacijos koeficientas: 5-15% patyrusiems naudotojams, iki 52% tarp operatoriu. Rezultatai priklauso nuo to, kas skaiciuoja ir kada.
Maziau nei 30 sekundziu vienam vaizdui. Beveik nuline variacija tarp operatoriu. Tas pats vaizdas, tas pats skaicius, kiekviena karta.
Lasteliu tipai, kurie gerai veikia
DI skaiciavimas tvarko platu lasteliu tipu ir preparatu spektra.
- Suspensijos lasteles (CHO, Jurkat, PBMC): nesudeetingas aptikimas su tripano melynio gyvybingumo daazymu
- Adherentines lasteles kulturoje: fazinio kontrasto vaizdinimas skaiciuoja lasteles nenukeliant ju nuo plokssteeles
- Kraujo lasteles: baltuju kraujo kuuneliu diferencialai ir trombocitu skaiciai is nudazytu tepineliu
- Bakteriju kolonijos: skaiciuokite KSV ant agaro plokssteliu is vienos nuotraukos
- Mieliu lasteles: pumpuojanciu ir nepumpuojanciu diferenciacija alaus daryklu ir biotechnologiju taikymams
Pagrindiines problemos yra stipriai persidengiiantys lasteliu klasteriai, tankkuus nuolauzu laukai ir labai mazos lasteles, eesancios zzemiau mikroskopo objektyvo skyros ribos. Daugumai standartiniu lasteliu kulturos darbu su 10X-20X didinimu DI skaiciavimas jau yra paruosstas gamybai.
Kaip pradeti be naujos irangos
Iejimo barjeras yra zemesnis nei dauguma mokslininkuu tikisi. DI lasteliu skaiciavimo irankiai veikia su esamais mikroskopu komplektais - nereikia specializuoto automatiniu skaitikliu. Pakanka standartinio laboratorinio mikroskopo su kameros priedu. Kai kurie irankiai netgi veikia su ismaniojo telefono nuotraukomis, darytomis per okuliaara.
Laboratorijoms, jau naudojancioms hemocitometrus, pereejimas yra greitas: uzfiksuokite vaizda, kuri paprastai skaiciuotumete akimis, ikelkite ji ir gaukite skaiciau su patikimumo perdanga. Hemocitometras lieka, skaiciavimas akimis dingsta.
Esme
Lasteliu skaiciavimas buvo rankinis, subjektyvus kliuutis moksliniu tyrimu laboratorijose daugiau nei simtmeti. DI nekeicia biologijos - jis keicia laika, nuosekluma ir skaiciavimo patikimuma. Maziau nei 30 sekundziu vietoj 15 minuciu. Maziau nei 6% paklaida vietoj 15-52% kintamumo. Tas pats rezultatas antradieni ir penktadieni.
Kita karta, kai lasteliu kulturos eksperimentas prasidees su 30 minuciu hemocitometru skaiciavimo, pabandykite nufotografuoti kamera. Skaaicius bus paruostas pries uzdarysi inkubatoriaus dureles.